PathScan®夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）抗体配对方案  A. 所需试剂:  1. 包被（缓冲）液：1X PBS，（20X PBS #9808）  3.2 mM Na2HPO4，0.5 mM KH2PO4，1.3 mM KCl，135 mM NaCl，pH 7.4  2. 漂洗（缓冲）液：1X PBS / 0.05% Tween-20，（20X PBST #9809）  3. 封闭（缓冲）液：1X PBS / 0.05% Tween-20，1% BSA  4. 1 X细胞裂解液：（10X Cell Lysis Buffer #9803）  短时间内这种溶液可以放在4°C（1- 2个星期）  注意：CST建议在使用前添加1mM苯甲磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF）  20 mM Tris (pH 7.5)  150 mM NaCl  1 mM ethylene diamine tetraacetate (EDTA)  1 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)  1% Triton X-100  2.5 mM sodium pyrophosphate   1 mM β-glycerophosphate   1 mM Na3VO4  1μg/ml leupeptin  5. TMB 底物：(TMB Substrate #7004)  6. 反应终止液：(STOP Solution #7002)  注意：这些试剂需现配现用。  B. 包被流程：  1. 用水漂洗微孔板。每孔加200 µl水然后倒掉。反扣在纸巾上务必将液体吸干。  2. 将捕获抗体按1：100用PBS稀释。为一块96孔板准备10 ml稀释抗体：在9.9 ml PBS中加入100 µl捕获抗体原  液。混匀后，每个孔加100 µl。封好后4°C孵育过夜（17-20小时）。  3. 在包被过夜后，轻轻撕去封膜，清洗各孔：  a. 将板中的溶液倒入废液缸中。  b. 用漂洗液洗4次，每次每孔200µl。每次清洗时，将微孔板用力扣在干净纸巾上，弃净所有液体，但  注意不要让微孔板完全干掉。  c. 用无尘纸擦拭所有孔的外底面  4. 封闭微孔板。每个孔中加入150 µl封闭液，盖好板后37°C孵育2小时。  5. 封闭后，按步骤3洗板。洗好后微孔板就可以用了。  C. 制备细胞裂解物  1. 吸去培养基。换上添加有调节因子的新鲜培养基，处理所需时间。  2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基并用冰冷的PBS漂洗一遍。  3. 除去PBS，每个10 cm盘中加入0.5 ml冰冷的含1 mM PMSF的1X细胞裂解液，冰上放置5分钟。  4. 将所有细胞刮下，转移至合适的离心管中。继续放在冰上。  5. 在冰上对样品进行超声处理。  6. 4°C离心10分钟，将上清转移到一个新管中。上清即为细胞裂解物。分装成足够一次使用的若干份保存在–  80°C。  D. 测试流程：1. 未稀释或在封闭液中稀释的细胞裂解物都可以用于实验。每孔加入100 µl细胞裂解物。盖上板并在37°C孵育2  小时。  2. 洗板如涂覆操作第3步。  3. 将检测抗体1：100稀释在封闭液中。每块96孔板准备10 ml稀释抗体，在9.9 ml PBS中加入100 µl的检测抗体  原液。混匀后，每孔加入100 µl。盖好板后37°C孵育1小时。  4. 洗板操作同包被流程第3步。  5. HRP偶联抗小鼠或抗兔的二抗用封闭液按1：1000稀释。每块96孔板准备10 ml稀释抗体，在9.99 ml PBS中  加入10 µl的二抗原液。混匀后，每孔加入100 µl。盖好板后37°C孵育半小时。  6. 洗板操作如包被流程第3步。  7. 每孔加入100 µl T MB底物。盖好后37°C孵育10分钟。  8. 每孔加入100 µl STOP溶液。  9. 在适当的微孔读板仪上测定各孔在450 nm处的吸光值。