Dam (G^mATC), Dcm (C^mCWGG) 和 CpG (^mCG) 甲基化                 

 

DNA 甲基转移酶（MTases）普遍存在于原核和真核生物中，它能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或
胞嘧啶上。当使用限制性内切酶消化 DNA 时，要考虑 DNA 是否有甲基化的问题，因为如果识别序列中某个特
定碱基被甲基化后，切割就会被完全或者不完全阻断。

 

原核生物甲基化

在原核生物中，DNA 甲基转移酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，它们的作用是保护宿主菌不被相
应的限制性内切酶切割。大多数实验室使用的大肠杆菌表达三种位点特异性的 DNA 甲基转移酶。

 

• Dam 甲基转移酶能将甲基转移到 GATC 序列中的腺嘌呤 N⁶ 位点上（1,2）。

• Dcm 甲基转移酶能在 CCAGG 和 CCTGG（1,3）序列内部的胞嘧啶 C⁵ 位置上甲基化。

• EcoKI 甲基转移酶可将 AAC (N⁶A) GTGC 和 GCAC (N⁶A) GTT 上的腺嘌呤进行甲基化修饰。

 

如果限制性内切酶的切割对象是从表达 Dam 或 Dcm 甲基转移酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与
内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能被阻断。例如，从 dam⁺ E. coli 中
分离的质粒 DNA 完全不能被识别序列为 GATC 的 MboI 所切割。

 

E. coli 菌株中的 DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能被完全甲基化（因此完全不能被 MboI 切
割)，而 λDNA 只有大约 50% 的 Dam 位点被甲基化，这是因为在 λ DNA 被包装到噬菌体头部之前，甲基化酶
还没来得及将 DNA 完全甲基化。因此，被 Dam 或 Dcm 甲基化完全阻断的内切酶只能对这些 λ DNA 进行部
分切割。

 

被 Dam 或 Dcm 甲基化阻断的限制性位点可以通过克隆方法去甲基化，即将 DNA 转至 dam^-/dcm^-  菌株中进
行繁殖 [如 dam^- /dcm^- E. coli 感受态细胞（NEB #C2925）]。

 

如果出现重叠位点，内切酶酶切也会被阻断。在这种情况下，Dam 或者 Dcm 序列一部分来自内切酶识别序
列，另一部分为识别序列左右旁侧的序列。在设计内切酶酶切时也应考虑到这种情况。

 

真核生物甲基化

在高等真核生物（如 Dnmt1）中发现的 CpG 甲基转移酶（CpG MTases），能将甲基基团转移至胞嘧啶残基
上的 C⁵ 位点。CpG 甲基化形式受遗传因素的影响，具有组织特异性，并与基因表达相关。因此，我们推测
CpG 甲基化在基因分化和表达中起了一定的作用（4）。

 

注意：在消化真核基因组 DNA 时尤其要关注 CpG 甲基化的影响。需要注意的是，一旦 DNA 被克隆到细菌中
后，将不存在 CpG 甲基化形式。

 

甲基化敏感性

下表总结了NEB 限制性内切酶的甲基化敏感性，表中列出了内切酶识别位点被 Dam、Dcm或 CpG 甲基化后
内切酶的切割是否被阻断或消弱。本表只对酶的特性提供参考信息，不能作为绝对依据。若想了解更多详细信
息以及本指南所基于的特定例子，请登陆限制性内切酶 REBASE 数据库 
( http://rebase.neb.com/rebase/ )。