免疫过氧化酶染色_友谊中联生物科技有限公司

技术资料

免疫过氧化酶染色

发布时间：2014-11-05 08:23 来源：未知

A. 组织培养细胞

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在无菌玻璃推片或载片(用于免疫组化的盖片和微载片)上37℃过夜培养细胞。用 PBS（缓冲液和常规液体）简短漂洗并用下述方法之一固定细胞：

1)	－10º C 甲醇中 5 分钟，空气干燥（推荐方法）；或
2)	冷丙酮中 2 分钟，空气干燥；或
3)	1% 甲醛PBS溶液中 10 分钟（保持湿润）

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PBS 漂洗 3 次

可选步骤：

在 0.1–1% 过氧化氢 PBS 中孵育 5–10 分钟，以灭内源性过氧化酶活性。PBS 漂洗 2 次，每次 5 分钟。

B. 冷冻组织切片

•	冷冻组织切块保存于液氮中（参考相应的标准方法）。组织冷冻切块切片前可储存于 -70º C 达 2 周。
•	95% 乙醇清洗玻片，用浸泡液处理并空气干燥，或用预处理的片子。
•	组织切成 4－10 微米厚的切片。切片贴在室温的载片上。片子可以放－70º C 保存。切片在室温下融化，然后固定和染色。

注意：

免疫组化mounting media目录包括Organo/Limonene 和 UltraCruz™ 参考免疫组化Mounting Media .

•	在冷丙酮中固定切片 10 分钟并保持冰冷（或选择其他固定方法）。PBS（缓冲液和常规液体）漂洗 3 次。

可选步骤：

在 0.1–1% 过氧化氢 PBS 中孵育 5–10 分钟，以灭内源性过氧化酶活性。PBS 漂洗 2 次，每次 5 分钟。

注意：

因为在石蜡包埋的组织中内源性生物素可被破坏，针对内源性生物素含量高的组织（此组织可造成高背景染色）我们建议用接下来的福尔马林固定的石蜡切片方法。

C. 福尔马林固定，石蜡组织切片

•	甲醛固定组织和石蜡包埋组织块请参考标准试验方法。
•	95% 乙醇清洗玻片，用浸泡液处理并空气干燥，或用预处理的片子。
•	将组织切成 4–6 微米厚的切片，并贴到载片上。用二甲苯去甲醛，更换二甲苯 3 次，每次 5 分钟。水化切片用逐渐改变乙醇梯度法：100% 乙醇 2 次，每次 10 分钟。然后 95% 乙醇 2 次，每次 10 分钟。最后用去离子水漂洗 1 分钟，并不断振动。吸干载片多余水分。

可选步骤：

可能在此时需要进行抗原修复。特定抗原的决定簇被甲醛固定和石蜡包埋所掩盖。可用下述方法之一进行修复。

1)	热修复（建议使用的方法）：将载玻片放入容器中，加 10 mM 的枸橼酸钠缓冲液，pH 6.0；或 50 mM 的甘氨酸－盐酸缓冲液（glycine: sc-29096sc-29092
2)	胃蛋白酶法：将切片放入 0.1% 胃蛋白酶 0.01 N 盐酸溶液，室温下孵育 10–20 分钟。去离子水漂洗片子数次。吸干片子上多余水份。
3)	皂甙法：切片放入 0.05% 皂甙去离子水溶液，室温下孵育 30 分钟。PBS 漂洗至少 3 次。吸干片子上多余水份。

可选步骤：

在0.1–1% 过氧化氢去离子水溶液中孵育5 –10 分钟以淬灭内源性过氧化酶的活性。PBS 漂洗 2 次，每次 5 分钟。

D. 免疫过氧化酶染色

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对于组织切片的免疫过氧化酶染色，我们建议使用圣克鲁斯生物技术公司的ImmunoCruz™ ABC 或者LSAB 染色系统。ImmunoCruz™ ABC染色系统用的是生物素标记的亲和素-生物素辣根过氧化物酶复合物为检测试剂。然而ImmunoCruz™ LSAB染色系统使用亲和素D-HRP复合体。ImmunoCruz™ 染色系统包含所有预先稀释的二级试剂，可直接使用。详细的实验步骤是包含在染色系统说明书中，简要的步骤如下。

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所有的步骤应在室温下保持湿润的容器中进行。所有的染色系统试剂在使用时应达到室温。组织切片在整个操作过程中保持湿润。每步反应步骤完成后将试剂吸出，但每步之间避免样品干燥。用足够的试剂覆盖样品（大约每张切片 100 µl ）

免疫Cruz&trade； ABC染色系统

•	用含10%的正常血清的PBS (缓冲液和常规试剂)室温孵育切片1小时。理想的封闭血清(免疫组化正常血清)应该与二抗来自于同一种属。移去封闭血清。
•	与一抗室温下孵育 30 分钟或 4º C 过夜。最佳的抗体浓度应通过滴度来获得。建议的浓度为 0.5–5.0 µg/ml PBS 稀释液，并加入 1.5% 的正常封闭血清。PBS 漂洗3次，每次 5 分钟。
•	与生物素标记的二抗孵育 30 分钟。可用所提供的浓度或大约 1 µg/ml PBS 稀释液，并加入 1.5% 的正常封闭血清。PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。
•	与卵白素生物素酶试剂孵育 30 分钟。PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。
•	与提供的过氧化物酶底物孵育 30 秒 –10 分钟，或达到理想的染色强度。具体的切片应该事先寻找合适的作用时间。用去离子水漂洗切片 5 分钟。如果复染，可用 Gill´s formulation #2 苏木精（sc-24973）5–10 秒。立刻用去离子水漂洗数次。
•	用乙醇和二甲苯脱水：95% 乙醇浸泡 10 秒，2 次。100% 乙醇浸泡 10 秒，2 次。二甲苯浸泡 10 秒，3 次。拭去多余的二甲苯。立刻加入 1–2 滴固定液（如 Clarion sc-24942），加盖片（sc-24975）光学显微镜下阅片。

ImmunoCruz™LSAB 染色系统

•	切片与 1–3 滴血清封闭液一起孵育 20 分钟封闭非特异抗原。然后从载片上吸去血清。
•	通过滴定来确定一抗在血清封闭液中的浓度0.5-5.0µg/ml。孵育2小时。用PBS(缓冲液和常规溶液)清洗。然后用 PBS 振动漂洗2次，每次2分钟。吸去载片上多余液体。
•	在 1–3 滴生物素化的二抗中孵育 30 分钟。如上漂洗切片。
•	加入1-3滴Avidin D-HRP复合物，孵育30分钟。如上漂洗。
•	加 1–3 滴 HRP 底物，反应 30 秒或直到出现预期染色。用去离子水冲洗并放入盛有去离子水的摇盘中漂洗 2 分钟。
•	复染，脱水和装片子如 ABC 染色系统中所述。

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