BD biocoat 基质和细胞检测系统
发布时间：2014-11-13 13:30 来源：未知
1 BD BiocoatTM MatrigelTM 基质
1.1 Matrigel 基底膜基质胶
BD产品货号：354230 354234 356230 356231 356234 356235 356237
储存和运输：-20℃储存，干冰运输。
操作指南：
BD采用专利技术，从富含胞外基质蛋白的EHS小树肿瘤中分离出BD Matrigel 基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，IV型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。BD Matrigel 基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。
BD Matrigel 基底膜基质形成的三维培养机制，可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时，Matrigel 还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支持外周神经的心生和牛输卵管上皮细胞的分化，高浓度的Matrigel 适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。
Matrigel 基质会有色差变化（淡黄色到深红色），是由于酚红和碳酸氢盐与CO2作用引起的。但是与5%CO2平衡后色差即会减少。冻融后，轻轻摇晃试剂瓶使Matrigel分散均匀。所有操作均需在无菌环境中进行。试剂瓶瓶盖可用70%乙醇擦拭，并自然干燥。应使用预冷的移液器以保证Matrigel呈匀浆状。
细胞可在0.5mm厚度的Matrigel基质层表面生长，也可在1mm厚度的Matrigel三维基质内生长。过度稀释的Matrigel会形成非胶质的蛋白层，也可以用于细胞贴壁，但不能用于细胞的分化研究。
注意：可将冻融后的Matrigel分装在多个小管，所有分装均需用预冷的冻存管，迅速冷冻并保存，避免多次冻融。
Matrigel在22-35℃温度环境下快速成胶，因此溶解时在4℃冰上过夜冻融（4℃时会随着温度的上升部分成胶）。所有用品在使用前需置于冰浴，必须使用预冷的移液管、吸头及小管操作Matrigel。成胶后的Matrigel可以在4℃24-48小时后重新呈液态。
推荐包被与成胶方法：
注意：为了保证Matrigel基质膜的成胶性能与稳定性，稀释浓度不应低于1:3，可用无血清培养基稀释，Matrigel成胶后立即使用。
薄胶成胶方法：
1、 冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。
2、 将需要使用的培养板置于冰上，加入浓度为50ul/cm2生长面积的Matrigel基质。
3、 在37℃放置30分钟，即可使用。
厚胶成胶方法：
1、 冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。
2、 将需要使用的培养板置于冰浴，将培养的细胞与Matrigel基质混合，用移液枪头使其悬浮于基质中。加入浓度为150-200ul/cm2生长面积的Matrigel基质。
3、 在37℃放置30分钟，可成胶。可以加入细胞培养的基质，可以是细胞直接生长在胶表面。
薄层包被方法：
1、 冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。
2、 根据使用需要，采用无血清培养基稀释Matrigel基质，根据实验需要确定最佳包被浓度。
3、 将稀释的Matrigel基质包被于所需的培养器皿中，包被量至少覆盖整个器皿的生长表面。室温下孵育1小时。
4、 去除未结合的Matrigel，用无血清培养基轻轻地冲洗。
用BD细胞回收剂（354253）或离散酶（354235）可降解Matrigel基质，冰浴7小时候回收得到细胞。
1.2 高浓度HC Matrigel基底膜基质胶
BD产品货号：354248 354262
储存和运输：-20度储存，干冰运输。
产品特性
Matrigel基质会有色差变化（淡黄色到深红色），是由于酚红和碳酸氢盐与CO2作用引起的，但是与5%CO2平衡后即会减少。冻融后，轻轻摇晃试剂瓶使Matrigel分散均匀。所有操作均需在无菌环境下进行，试剂瓶盖可用70%乙醇擦拭，并自然干燥。应使用预冷的移液器以保证Matrigel呈匀浆状。
细胞可在0.5 mm厚度的Matrigel基质层表面生长，也可在1 mm厚度的Matrigel三维基质内生长。过度稀释的Matrigel会形成非胶质的蛋白层，可以用于细胞贴壁，但不能用于细胞的分化研究。
注意：可将冻融后的Matrigel分装在多个小管，所有分装均需用预冷的冻存管，迅速冷冻并保存，避免多次冻融。
Matrigel在25-35℃温度环境下快速成胶，因此溶解时在4℃冰上过夜冻融（4度时会随着温度的上升部分成胶）。成胶后的Matrigel可以在4℃ 24-48小时后重新呈液态。
注射步骤：
1、 注射前，必须保证Matrigel细胞悬浮液在不冷冻的情况下，尽可能地保持低温，同时保证每一步都无菌操作。
2、 对于每只注射小鼠，冰上混合0.5 mL细胞（2×105或更多细胞）和 Matrigel混合液。
3、 细胞注射体积需尽可能小。通常，用含有2×106/mL细胞的250 μL预冷培养基，混合250 μL冰浴的Matrigel。
4、 小鼠皮下注射，19G针用于组织样品，23G针用于培养的细胞。注射动作必须快速，以避免Matrigel凝固。
5、 抽出注射器时旋转以防止泄漏。针头需要经常更换以避免堵塞。
用BD细胞回收剂（354253）或离散酶（354235）可降解Matrigel基质，冰浴7小时后回收得到细胞。
1.3 人来源细胞外基质
BD产品货号：354237
储存和运输：-20度储存，干冰运输。
产品特性
人源细胞外基质是来源于人体胚胎、经过层析纯化而得的细胞外基质提取物，由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）等成分组成。人细胞外基质对贴壁依赖性上皮细胞特别是人源性细胞，有促进其贴壁、延展、代谢和分化的作用。
配方：0.02M磷酸钠溶液，pH值7.4
包被方法：
1 用无血清培养基吸收细胞外基质到一定的浓度。最终浓度应足以满足覆盖培养器皿表面的量。例如：最终包被浓度为5.0 μg/cm2，应将基质稀释到50 μg/mL，在35 mm的培养皿中加入1mL基质，在60 mm培养皿中加入3 mL基质。
2 根据培养皿面积加入合适的已稀释基质。
3 室温孵育2小时。
4 吸走多余的基质。
5 仔细清洗培养器皿，避免刮擦底部表面。
6 包被以后的培养器皿，应储存于2-8℃的潮湿环境中，或在无菌环境中自然干燥。
1.4 Ⅲ型人重组胶原蛋白
BD 产品货号：354255
储存和运输：-20度储存，干冰运输。
操作指南：
Ⅲ型胶原在皮肤、心血管系统和成年人的正常生理功能中发挥重要作用。Ⅲ型胶原蛋白在正常人心血管纤维形成中起重要作用，还可用作促进细胞贴壁和调节细胞行为。
使用注意事项：
Ⅲ型人重组胶原蛋白，可用于体外实验的薄胶包被，但也能优化用作胶。如果一次不能使用完，可分装后储存于2-8℃。
推荐包被与成胶方法
薄胶包被：
1、 选择合适的包被浓度。推荐包被浓度为：0.2-2 μg/cm2，视细胞种类决定。加入的包被体积必须足以覆盖细胞生长表面。如有必要，可将胶原蛋白用10 mM醋酸稀释。
2、 当生长表面完全覆盖后，室温孵育2小时。倾斜培养皿至45度，使多余的胶原蛋白都聚集在培养皿的最低点。
3、 用移液器去除多余的胶原蛋白。
4、 在层流超净台上空气自然干燥或用灭菌的柔后气流干燥。
5、 器皿包被完成，可备用。
成胶方法：
1、 加入9份的人重组胶原蛋白和1份的10倍中性缓冲液或无菌组织培养基。
2、 将混合液加入需要的培养器皿中。
3、 室温孵育60分钟。
4、 细胞可接种于胶的表面。如需将胶从培养皿中转移或用于更多操作，在成胶前混合细胞和胶原蛋白。
1.5 高浓度层粘连蛋白/巢蛋白混合物
BD 产品货号：354259
储存和运输：-20度储存，干冰运输。
操作指南：
层粘连蛋白/巢蛋白混合物是EHS小鼠肿瘤基质膜的主要成分。纯化后，成等摩尔浓度分布。二价阳离子有利于混合物的形成。在2mg/mL浓度时，层粘连蛋白/巢蛋白可以形成三维胶，可用于细胞生长和分化的研究。三维胶更接近体内微环境。细胞的分化受到与单一或混合细胞外基质蛋白之间的相互作用的影响，因此在层粘连蛋白/巢蛋白混合物上培养细胞，可以用以观察并揭示细胞分化和功能性的特性机理。混合蛋白的成胶过程对温度敏感。此外，高浓度的层粘连蛋白/巢蛋白（2-6mg/mL）也用于人下颌腺泡细胞和内皮细胞的血管形成研究。
注意事项：
1、 所有操作的工作温度不能高于4℃，蛋白需冰上操作保存，用冰块冷却的溶液或细胞悬浮液稀释。
2、 由于混合蛋白溶液粘性较高，必须使用预冷的注射器型移液管，如Gilson M系列；避免使用气压式移液管或吸头。
推荐包被方法
铺胶步骤：细胞在胶表面培养
1、 冰上溶解混合蛋白，所有操作均在冰浴上进行。
2、 稀释到需要的浓度：稳定成胶浓度至少为3.5mg/mL。
3、 用预冷的等压盐溶液或0.1mM钙离子培养基稀释。
4、 将稀释的蛋白溶液加入到培养器皿，1-2小时，37℃成胶。
铺胶步骤：细胞在胶内部培养
1、 冰上溶解混合蛋白，所有操作均在冰浴上进行。
2、 根据加样体积计算并稀释混合蛋白，成胶浓度至少为3.5mg/mL，稀释过程需在预冷的培养器皿或小管中进行。
3、 加入预冷的细胞悬液，用等压盐溶液或培养基调节溶液浓度到第二步所需的浓度。
4、 用Gilson M系列移液管混匀混合蛋白和细胞悬液。
5、 将混合后的细胞蛋白悬液加入到预冷的培养板中，37℃孵育1-2小时成胶。
1.6 人胚胎干细胞专用的Matrigel基质（Matrigel hESC-qualified Matrix）
BD产品货号：354277
储存和运输：-20度储存，干冰运输。
产品特性
Matrigel基质会有色差变化，是由于酚红和碳酸氢盐与CO2作用引起的，不会影响产品效率；与5%CO2平衡后色差即会减少。冻融后，混旋使充分分散溶解。所有操作均需在无菌环境下冰上进行，冻融管的表面需用70%乙醇清洗，并自然干燥。应使用预冷的移液器以保证呈匀浆状。分装的胶要用合适的分装份数，用预冷的冻存管，迅速冷冻，避免多次冻融；
不要保存在除霜冰箱中！
稀释影响因子：
hESC优化的Matrigel基质稀释需要根据各个批号的蛋白浓度进行。与干细胞培养技术相关的培养基一起使用时，里面要根据分析证书提供的影响因子浓度分装基质。液体可以在-70℃储存6个月。通常分装体积在270-350微升。
使用时：
加入一个分装量的基质到25mL的DMEM/F-12，包被6-孔板（1/mL每孔），或者3个100mm直径的培养皿（8mL/皿）。
注意：
hESC优化的Matrigel基质354277可以在27-35度迅速凝胶，可在冰上4度过夜解冻；成胶后的Matrigel可以在4℃ 24-48小时后重新呈液态。
2 BD BiocoatTM 细胞检测相关系统
2.1 Biocoat肿瘤侵袭系统
BD 产品货号：354166, 354165
储存和运输：-20度储存，干冰运输。
使用指南
BD BiocoatTM 肿瘤侵袭系统由包被Matrigel基质的特殊材质BD FluoroBlok 荧光屏蔽8.0μm PET膜的培养小室组合而成。BD BiocoatTM 肿瘤侵袭系统具有以下特点：提高肿瘤细胞侵袭实验的通量；自动化非破坏式的荧光检测；节约抗肿瘤转移药物筛选的时间和劳动力；高度可重复性：平均z’=0.7(24孔)；平均z’=0.66(96孔)；使用简便：无需反复取液和操作，仅需加入细胞、标记物，然后直接读板。
操作过程
1、 冻融
1.1 从-20℃冰箱中取出产品，使其自然升温到室温。
1.2 取出培养板在细胞小室内加入到500μL 37℃预热的PBS，37℃无CO2环境下孵育2小时。
1.3 解冻后，小 心去除小室内的培养基，避免破坏Matrigel基质膜。
2、 BD钙黄绿素Calcein AM荧光染色剂后标记法
细胞通过侵袭消化基质膜后迁移到下小室，采用荧光标记定量细胞。细胞的侵袭能力用终点计算法计算得到。对于采用实时动力曲线的计算，推荐使用前标记法。
2.1 如步骤1准备培养板。
2.2 胰酶消化细胞单层后制得细胞悬液，溶于无血清DMEM培养基，推荐浓度为5×104 cells/mL。
2.3 上小室中加入500μL细胞悬液（2×104 cells）。
2.4 通过进样口在下小室中加入750μL诱导剂。
2.5 在37℃，5%CO2 条件下孵育培养板和对照板20-22小时（由细胞类型决定）。
2.6 孵育后，小心去除上小室中的培养基。避免破坏Matrigel基质膜。可以通过反扣住培养板，轻轻拍打，以使培养基的倾倒。
2.7 将培养小室转移到另一块24孔板中，该孔板含有0.5 mL每孔的4μg/mL 钙黄绿素（溶于HBSS）。在37℃，5%CO2的环境下培养一小时。
3、DilC12（3）荧光染色剂预标记法
细胞接种于孔板之前先用染色剂标记，可用于均一化实验，所产生的实时动力数据可揭示细胞通过基底膜侵袭的动力曲线，不需要分解和破坏各个时间点。
3.1如1.所示冻融。
3.2 10μg/mLDilC12(3)溶解于含10%FBS的DMEM中，37℃ 1小时标记单层细胞。
3.3 胰酶消化细胞单层，制备细胞悬液，溶于无血清DMEM培养基，浓度为1×105 cells/mL。
3.4 上小室加入500μL细胞悬液（5×104cells）。
3.5通过进样口在下小室加入750μL诱导剂。
3.6 在37℃，5%CO2环境下孵育培养板和对照板18-24小时（由细胞类型决定）。在549激发波长和565nm发射波长条件下进行荧光读数。
4、数据计算
侵袭率%=受趋化剂诱导通过Matrigel基质膜的细胞平均相对荧光值/受趋化剂诱导通过未包被FluoroBlok荧光膜的细胞平均相对荧光值×100
注意：数据可以用相对荧光值RFU或侵袭百分比表示，后者在标准化数据处理中更有用。背景扣除，计算平均背景值，将其从各个孔板中扣除。
自动化操作注意事项
1. BD Falcon FluoroBlok 24孔板培养小室系统能适用于自动化操作系统。盖子可以用标准机械手取走，也可用吸力取走。
2. 为了避免各孔间污染，孔板设定为一个统一的方向。为了与培养小室匹配，确保Falcon的商标均在2者上方，面向同一个方向。
3. 任何规格的枪头都能达到小室的两边。包括50μL，100μL，200μL，250μL，1000μL。
2.2 Biocoat 血管生成系统：内皮细胞侵袭
BD 产品货号：354141、354145、354146
储存和运输：-20度储存，干冰运输。
操作指南
血管生成过程中，内皮细胞活化后表达基质蛋白酶（MMPs），可降解血管基底膜。BD Biocoat 内皮细胞侵袭系统提供了抗/促血管再生化合物的体外定量实验模型。内皮细胞侵袭系统包括：BD Falcon24多孔培养小室，含配套接收板和盖子；BD fluoroBlok荧光屏蔽3.0μm孔径PET膜，预包被Matrigel基质，具体操作步骤如下：
操作过程
1、冻融
1.1 从-20℃冰箱中取出包装，使其自然升温到室温。
1.2 在小室内加入0.5ml37℃预热的基本培养基，在37℃CO2环境下冻融15-45分钟，待用。
1.3 冻融后，小心去去除培养基，避免破坏Matrigel基质膜。可用抽吸或倒置培养板并轻拍的方法去除培养基。
2、侵袭实验：用BD钙黄绿素Calcein AM荧光染色剂后标记
细胞侵袭基质膜穿过荧光标记膜后，采用荧光标记定量。
2.1 采用如1.1的步骤冻融，对照板无需冻融。
2.2 胰酶酶解细胞单层，使其悬浮在无血清培养基中，浓度为2.0×105/mL。最佳的接种细胞浓度需要采用一系列细胞浓度进行优化，包括在下室培养表面的浓度（例如，培养瓶，培养皿和培养板）。例如，接种浓度为105cell/cm2时，采用浓度为0.5×105到5.0×105 cell/cm2的范围确定最佳的接种浓度。
2.3 在上小室中加入0.25mL的细胞悬浮液（5.0×104 cell/well）。
2.4 通过进样口，快速加入750μl含5%FBS或适量生长因子（比如BDVEGF）的培养基，作为底部小室的化学诱导剂。
2.5 小室和对照小室在37℃，5%CO2环境下培养22±1小时。
3、细胞侵袭能力的测定：用BD钙黄绿素Calcein AM荧光染色剂后标记定量
注意：对于每一个完成得培养板，需要12.5mL的HBSS和50μg的钙黄绿素。HBSS的使用时为了减少荧光染色剂自动水解引起的高背景荧光。
3.1 准备浓度为4μg/mLd 高黄绿素。12.5mL的HBSS37℃预热。50μg高黄绿素用20μLDMSO溶解，加入150μL预热的HBSS。将其转入大量的HBSS中，用150μL预热的HBSS清洗荧光染料的容器。
3.2 孵育后，小心去除上小室中的培养基。注意小心转移邻近小室底部的培养基。可以通知抓住培养板，轻轻拍打，使培养基从下部滴落。避免破坏Matrigel基质膜。
3.3 将培养小室转移到另一块24孔板中，该孔板含有0.5mL每孔的4μg/mL钙黄绿素。在37℃，5%CO2环境下孵育90分钟。
3.4 侵袭小室的荧光定量信息通过荧光板读板机底部读数取得，激发波长494nm，发射波长517nm。只有侵袭并通过Matrigel FluoroBlokTM膜后细胞才能被检测。
注意：后标记所使用的染色剂不局限于胞核染色，比如SYTO-24，在血清培养基环境中具有较低背景，不需要使用第二块板用于标记。
4、侵袭研究：DilC12（3）荧光染色剂预标记法
细胞接种于孔板之前先用于染色剂标记，可用于均一化实验，所得到的实时动力曲线可揭示细胞通过基底膜侵袭的能力，不需要分解和破坏各个时间点。
4.1 如1.1所示冻融。
4.2 不同浓度的各类荧光素对细胞标记的程度不同，标记浓度和时间，接种细胞浓度和化学诱导剂必须先优化。
4.3 胰酶消化细胞单层，制备细胞悬液，溶于无血清DMEM培养基，浓度为2×105cell/mL。最佳的接种细胞浓度需要采用一系列细胞浓度进行优化，包括在下室培养表面的浓度（例如，培养瓶，培养皿和培养板）。例如，接种浓度为105cell/cm2时，采用浓度为0.5×105到5×105 cell/cm2的范围确定最佳的接种浓度。
4.4 在上小室中加入0.25mL的细胞悬液（5.0×104cell/小室）。
4.5 通过进样口，快速加入750μL含有5%FBS或适量生长因子（如BD VEGF）的培养基，作为下室的诱导剂。
4.6 小室和对照小室在37℃，5%CO2环境下培养22±1小时。
5、细胞侵袭的计算：用DilC12（3）荧光染色剂后标记定量
侵袭小室的荧光定量信息通过荧光板读板机底部读数取得，激发波长549nm，发射波长565nm。只有侵袭通过Matrigel FluoroBlok膜被标记的细胞才能被检测。
6、结果计算
注意：数据可以用相对荧光值RFU或侵袭百分比表示，后者在标准化数据处理中更有用。
背景扣除：计算平均背景值，将其从各个孔板中扣除。
6.1 侵袭百分比
侵袭百分比%=通过基质膜包被的荧光膜侵袭细胞的平均相对荧光值/通过未包被荧光膜侵袭的平均相对荧光值×100
6.2 信噪比
信噪比S/N=实验组细胞侵袭的相对荧光值/对照组细胞侵袭的相对荧光值
自动化操作注意事项
1 BD Falcon FluoroBlok 24孔板培养小室系统能适用于自动化操作系统。盖子可以用标准机械手取走，也可用吸力取走。
2 为了避免各孔间污染，孔板设定为一个统一的方向。为了与培养小室匹配，确保Falcon的商标均在2者上方，面向同一个方向。
3 任何规格的枪头都能达到小室的两边。包括50μL，100μL，200μL，250μL，1000μL。
2.3 Biocoat血管生成系统：内皮细胞迁移
BD产品货号：354143 354144 354147 354148
储存和运输：-20度储存，干冰运输。
操作指南
血管生成过程中，内皮细胞活化后表达基质金属蛋白酶（MMPs），可降解血管基底膜。BD Biocoat内皮细胞侵袭系统提供了抗/促血管再生化合物的体外定量实验模型。内皮细胞侵袭系统包括：BD Falcon 24多孔板培养小室，含配套接收板和盖子：BD FluoroBlok荧光屏蔽3.0μm孔径PET膜，预包被Matrigel基质。具体操作步骤如下：
1、 冻融
从-20℃冰箱中取出包装，使其自然升温到室温。
2、 迁移实验：用BD钙黄绿素Calcein AM荧光染色剂后标记
细胞在BD FluoroBlokTM 基质膜迁移后，采用荧光标记定量，只有迁移到下室的细胞可以计算得到。根据实时动力曲线的计算，推荐使用前标记法。
2.1 原代HUVEC细胞的迁移能力取决于其来源和所传代数。可以先对HUVEC迁移能力进行预筛选，推荐使用所传代数较低，8代以内的HUVEC。
2.2 HUVEC细胞在血清培养基或生长因子VEGF优化的培养基中生长，会对不同的内皮细胞诱导剂产生不同的应激反应。
建议在实验前将细胞饥饿4-5小时，而后去除生长培养基，清洗细胞单层，加入含0.1%BSA的基础培养基（不含血清或生长添加剂）。
2.3 HUVEC细胞悬液可用胰酶消化后制备，然而，采用非酶技术消化细胞，更能保存细胞迁移的应激能力。可采用专业培养基Specialty Media (产品号：S-014-B)作为非酶消化的离散剂。
注意：大部分内皮细胞培养基不具有足够的血清浓度用于终止胰酶的消化。
2.4 接种细胞浓度同实验条件，如细胞来源，培养基，化学诱导物决定。推荐起始浓度为：4.0×105 cells/mL 24孔板或3.3×105个/mL 96孔板。推荐接种体积分别为250μL和75μL.
2.5 推荐的化学诱导物体积分别为24孔板，750微升，96孔板，225微升。
注意：为了减少气泡和优化荧光读板的性能，推荐通过进样口在配套板内添加试剂。
2.6 小室和对照小室在37℃，5%CO2环境下培养22±1小时。
3、细胞迁移的计算：用BD钙黄绿素Calcein AM 荧光染色剂后标记定量。
注意：钙黄绿素的浓度在4-5μg/mL（HBSS溶液）。采用培养基用于荧光染色剂的稀释会引起荧光染色剂自动水解，并带来高背景荧光。
对一块完整的24孔板来说，需要一管溶解于12.5mL HBSS的50μg的染色剂。96孔板则需要2管溶解于25mL HBSS的50μg染色剂。
3.1 在各管50μg钙黄绿素中加入20 μL DMSO，加入150μL 37℃预热的HBSS。将其转入大量的HBSS中，用150μL预热的HBSS清洗荧光染料的容器。
3.2标记有2种方法
第一种适用于大规模孔板的自动化加样操作。小室和孔板内的培养基通过加样口添加。通过进料口加入HBSS清洗孔板和膜底部（24孔板需500μL,96孔板需200μL），反复抽吸。在24孔板中加入500μL钙黄绿素，96孔板中加入225μL。
第二种方法是手动操作较水数量的培养板。取出培养小室，轻摇后去除溶液。去除培养基后，将小室转入另一块新的培养板，该培养板在、预先溶有染色剂（24孔板，每孔500μL，96孔板每孔225μL）。
3.3 在37℃，5%CO2环境下孵育90分钟。
3.4 培养小室的荧光定量信息通过荧光板读板机底部读数取得，激发波长494nm ，发射波长517nm。只有迁移后通过Martigel FluoroBlok膜的被标记的细胞才能被检测。
4、迁移研究：DilC12(3)荧光染色预标记法
细胞接种于孔板之前先用染色剂标民，可用于均一化实验，所产 生的实时动力数据可提示细胞通过基底膜侵袭的动力曲线，不需要分解和破坏各个时间点。
4.1 如1.所示冻融。
4.2 不同浓度的各类荧光素对细胞标记的程度不同，标记浓度和时间，接种细胞浓度和化学诱导剂必须预先优化。
4.3 接种密度参见步骤2.在小室内加入0.5 mL 37℃预热的基本培养基，在37℃，CO2环境下孵育15-45分钟，待用。
4.4 培养小室的荧光定量信息通过荧光板读板机底部读数取得，激发波长549nm，发射波长565nm。只有迁移后通过Matrigel FluoroBlok膜的被标记的细胞才能被检测。
5、结果计算
注意：数据可以用相对荧光值RFU或迁移百分比表示，后者在标准化数据处理中更有用。
背景扣除：计算平均背景值，将其从各个孔板中扣除。
迁移百分比%=受化学诱导的跨膜迁移的细胞平均荧光值/不受化学诱导的跨膜迁移的细胞平均荧光值×100
自动化操作注意事项
1 BD Falcon FluoroBlok 24孔板培养小室系统能适用于自动化操作系统。盖子可以用标准机械手取走，也可用吸力取走。
2 为了避免各孔间污染，孔板设定为一个统一的方向。为了培养小室匹配，确保Falcon的商标均在2者上方，面向同一个方向。
3 对于96 孔板培养小室，需使用锥形头或窄孔口的吸头。宽口枪头会粘在储存口上，不利操作。
4 任何规格的枪头都能达到小室的两边。包括50μL，100μL， 200μL，250μL，1000μL。
