简介
        免疫组化( IHC) 常用于确认肿瘤或其他组织癌变的形态特征。 在保持原组织成分、 细胞特征以及结构的情况下， IHC 利用抗体检测和分析该组织细胞中的蛋白质表达。 化学固定常用中性缓冲福尔马林( neutral buffered formalin, NBF) 或甲醛将细胞内以及细胞间分子相互作用固定在原位。 组织样品在被切成切片以及装入载玻片以供分析之前， 可在固体石蜡中包埋或在低温溶液中进行冷冻保存。 针对不同的样品或检测靶标， 有不同的组织收集、 保存和固定方法。
        IHC 通过结合特异性抗体来识别生物样品中蛋白质的存在以及表达方式。 抗体与其靶点蛋白质表位的精确结合可检测蛋白质中具有高度特异性的氨基酸序列。 抗体也可检测蛋白质的特异翻译后修饰( post–translational modifi cations, PTM) 。磷酸化特异性抗体已用于确定特定信号通路分子以及研究在不同的生物学背景下磷酸化事件中的变化。 近来， 人们研发出了用于检测其他PTMs 的特异性抗体， 这使得研究人员可以监控蛋白质乙酰化、 甲基化或泛素化状态的变化。
        在 Cell Signaling Technology (CST ) 专门从事IHC 的科学家检测了大量的抗体，只推荐了其中最适合应用于IHC 的抗体。 我们的科学家对大量的抗原修复和免疫染色方法进行了检测，确定了IHC 中各抗体的最佳使用条件。 此外， 科学家还研制了IHC 配套试剂， 以加强抗原的检测并改善IHC 操作的有效性。 
        在此， 我们将重点讲述IHC 操作流程中的关键步骤， 并提供数据以支持及解释我们在实验过程中所提的建议。 此外， 我们也将讨论在IHC 实验过程中， 使用经严格验证抗体的至关重要性。最后，本指南列出了CST 科学家内部常用且最适用于与抗体配套使用的IHC 试剂。



经严格验证的抗体的重要性
        一抗在任何IHC 检测中都至关重要， 对数据质量存在直接影响。 质量较差的一抗可对实验结果造成干扰， 导致结果无法解释或存在误解。 某一抗体的单一组织样品阳性染色结果不足以证实其在IHC 中的可用性。 抗体应通过严格的验证过程， 以确保其可精确地检测到靶点。

IHC 验证过程包括：
   运用免疫印迹分析评估交叉反应条带。
   运用已知靶点蛋白表达水平的细胞株制作的石蜡包埋细胞团进行特异性检测， 包括通过磷酸化、乙酰化、剪切等处理方法验证修饰特异性。
    通过磷酸酶处理方法验证磷酸化特异性。
    利用阻断肽验证特异性，并排除Fc介导的结合、生物素背景以及其他非特异性染色。
    对相应的患癌小鼠模型进行特异性检测。
   对已知靶点蛋白表达水平的细胞株产生的异种移植物进行特异性检测， 包括对应药物治疗后靶点表达的调节。
   利用人类组织芯片对各种组织类型进行抗体功能检测。
    在适当的情况下，对新鲜的冷冻组织进行抗体功能检测。

掌控您的IHC检测
        将抗体添加到组织中并获取信号是一件很容易的事情。 但是， 所获得的信号是特异的吗？在任何实验中， 我们都应考虑包含适当的对照。 阳性和阴性对照可使您进一步确定您的抗体检测到预定的靶点。在检测组织之前， 可利用各种细胞株和处理条件在细胞水平上评估抗体性能。 例如， 利用阳性表达和阴性表达的细胞株评估总蛋白抗体的特异性。 此外， 由已知可引发信号变化的生物或化学调节剂处理细胞， 以检测修饰特异性， 如磷酰化、 乙酰化、 剪切等。 经磷酸酶处理后， 可对磷酸化抗体做进一步评估。 此外， 同型对照抗体有助于排除因Fc受体结合或其他蛋白质与蛋白质相互作用引起的一抗的非特异性染色； 同型对照抗体应与检测抗体具有相同的免疫球蛋白类型。

关键步骤：
载玻片制备
        请注意：查阅产品说明书以确定产品是否经过验证可用于石蜡包埋(IHC–P) 或冷冻(IHC–F)样品。 鉴于大多数源自CST 的IHC 适用抗体被用于石蜡包埋样品，所以我们在此将主要对IHC–P 操作流程提出建议。操作步骤的变动将会被酌情指出。
IHC-P：石蜡包埋细胞团和组织
        免疫染色前， 需收集细胞团样品并将其固定于10%的中性缓冲福尔马林(NBF) 中， 以维持细胞形态和抗原表位。 利用自动处理机对样品进行脱水， 并将样品浸润于固体石蜡。 将浸润石蜡的样品置于装有少量液态石蜡的模子中， 将其冷却。 利用切片机获取厚度为4–6 μ m 的样品， 并将其置于有助于样品粘附的带正电荷的载玻片上。关于如何制备贴壁和悬浮细胞的石蜡包埋细胞涂片的所有细节，请参见IHC实验成功指南第 12  页的《细胞涂片制备流程》。对于组织样本而言，IHC 抗体对收集、固定和石蜡包埋步骤的要求因具体组织类型而异。
IHC-F：冷冻组织
        切片前， 应将冷冻组织储存于–80 ℃的温度下，然后包埋入OCT包埋剂。 准备染色时，切片前将组织置于–20 ℃环境中15分钟以平衡组织成分。利用切片机获取厚度为6–8 μ m 的组织， 并将其置于带正电荷的载玻片上。为进一步帮助样品粘附于载玻片上，我们建议在固定前，将载玻片在室温下风干几分钟，以清除所有的残余水分。查阅产品说明书中所推荐的最佳固定剂和固定条件。
载玻片存储
以下内容仅适用于石蜡包埋样品。
       使用最新制备的载玻片以获得最佳结果。 长时间存储可能导致载玻片样品失去抗原性。 该过程会有所不同， 视靶点蛋白质而定。 因为各蛋白质的载玻片存储对染色的影响不明，所以在使用之前，制备新载玻片是最佳方法。如果载玻片必须存储，则将其存储于4℃的无烘烤环境中。
脱蜡/复水
以下内容仅适用于石蜡包埋样品。
        为使抗体结合及染色， 需将石蜡完全清除。 这需要经过一系列的二甲苯/ 乙醇/ 水清洗， 以清除石蜡， 并使组织复水以便于之后的抗体结合。 石蜡清除不彻底可导致染色出现斑点及背景染色不均匀。 如发生该情况， 则需利用新鲜的二甲苯制备新切片以重复实验。 脱蜡和复水步骤完成
后，则需在接下来的操作流程中避免载玻片变干。
抗原修复
以下内容仅适用于石蜡包埋样品。
       因为固定时形成的交联可通过阻止抗体与抗原接触来防止抗体结合； 因此， 需通过抗原修复（ 也称为抗原暴露或抗原表位修复） 的过程来逆转交联。抗原修复可通过热诱导的方法（heat–induced epitope retrieval, HIER ）或者酶解达到。产品说明书中将明确阐述用于CST™ 抗体的推荐
方法。