设为首页 | 加入收藏
当前位置:主页 > 专业资源 > 技术资料 >
技术资料
β-actin居然可以两条带?!
发布时间:2017-07-07 11:57 来源:ProteintechGroup
身为内参界的大腕,β-actin凭借稳定单带的优点集万千宠爱于一身!
然鹅,万万没想到,β-actin也有“掉链子”的时候!那出现两条带的beta-actin究竟对不对呢?
 
我们先来看下面这两个 β-actin的检测:
两个 β-actin的检测
(图片来源于网络)
第一个图中一条带的 β-actin 的正确性是毋庸置疑的,但是第二个图中actin俨然不止一条带。我们先来看看这个问题是否普遍存在:
这个问题是否普遍存在
作为内参的 β-actin多条带问题这么普遍,那究竟是什么原因呢?
原来科学家们发现,有很多酶都可以降解actin(由于不同actin亚型序列差别不大,所以下面统称actin。这一系列酶的种类多得超乎你想象!
一系列酶
除了这些酶的作用,在有些特殊的刺激下,比如凋亡,actin也会降解!
降解
咱们熟悉的42 kDa的actin,发生降解后会产生35-38 kDa、~30 kDa, 15 kDa等典型片段来,其中35-38 kDa的片段最为常见,这是因为不少酶都会在Val43和Met44这两个氨基酸中间切开它,也就是下面这个意思:

综上所述,如果actin出现多条带,建议从以下几个方面考虑解决:
1. 像上面提及的凝血酶、组织蛋白酶等在各组织里和细胞里的分布比较广泛,在裂解过程中它们极有可能是降解actin的主要因素,因此需要设法抑制蛋白酶活性,比如引入蛋白酶抑制剂、避开蛋白酶最适活性温度等;
2. 对于贴壁细胞,在传代过程中使用的胰酶也是一个潜在威胁,在传代的时候需要控制好消化时间,防止消化过度,尤其是在最后一次传代时,细胞密度尽量传低,以充份稀释残留的胰酶,同时提高未被降解的细胞的比例。
3. 保持细胞处于良好的状态,防止发生凋亡。对于研究凋亡的童鞋来说,可以考虑用其它内参。
4. 防止细胞被微生物污染、防止裂解产物被微生物污染,提蛋白的全部器皿尽可能干净无微生物污染。
但是,针对富含大量蛋白酶的组织(如消化系统组织)和细胞(如U-937, Raw264.7等细胞),即使用了上述方法,依然有较大可能出现actin被降解的可能。那怎么办?
不用担心,Proteintech已经完美解决这一问题!
我们来看看Proteintech的两支 β-actin单抗:
Proteintech的两支 β-actin单抗
Proteintech的60008-1-Ig可以识别出一条降解片段来,但是66009-1-Ig只能测出全长来,原因就是66009-1-Ig识别的位点位于前43aa内。
所以,当实在无法解决beta-actin出现降解条带但又需要漂亮图图的,如果确认目的蛋白不受降解影响或影响极小的,可以考虑采用Proteintech 的66009-1-Ig来解决。
另外需要注意的是,N端的序列在物种间的保守程度不如C端,因此Proteintech 的 β-actin抗体60008-1-Ig可以识别更广泛的物种,最低可以识别酵母actin, 而66009-1-Ig只能识别线虫或更高等的动物。
为了方便大家选择产品,我们顺便把这两个产品的对比列出来:
两个产品的对比
(注意:60008-1-Ig亚型为IgM,不适合做IP实验。)
怎么样,WB要重做的理由又被K.O了一个,有木有很开心?