1．什么是ChIP（染色质免疫沉淀）？
染色质免疫沉淀(ChIP)分析是一种用于探测在细胞自然的染色质环境中蛋白质-DNA的相互作用的，有效并应用广泛的技术。这种分析可用于确定与基因组特定区域相关的多种蛋白质，或反过来，用于确定与一个特定蛋白相关的许多基因组区域。另外，ChIP可用于明确特定的蛋白质-DNA相互作用是因为空间结构还是暂时性的。除了组蛋白外，ChIP分析也可用于分析转录因子，转录辅因子，DNA复制因子和DNA修复蛋白的结合。
2．为什么酶解染色质比超声片段化染色质更好？
虽然超声法是用于染色质片段化的传统方法，但由于超声波的易变性和超声过程中染色质样品的乳化会使许多问题发生。超声不足会导致染色质不完全片段化，过度超声或样品乳化会因蛋白质变性或降解而丢失抗体表位。我们进行了ChIP样品处理的方法对比，发现从培养细胞中酶解染色质比超声要温和得多，在ChIP分析中免疫沉淀效率有明显提高。比较基于组织的ChIP试剂盒，也显示从组织样本中酶解染色质，免疫沉淀效率增加。
3．我收获的细胞或组织量是怎样影响我在消化过程中所使用的微球菌核酸酶的量的？
测量用于准备染色质的细胞数或组织量是非常重要的。我们建议每次免疫沉淀反应需要4x10⁶细胞或25mg组织。在酶解染色质前，组织样品被交联，分解成单细胞悬浮液。细胞数与加到染色质中的微球菌核酸酶的体积的比率对于将染色质片段化到合适大小（150到1000bp）非常重要。虽然这个比率随细胞、组织类型不同而稍微不同，我们发现4x10⁶细胞（或25mg组织）与0.5μl的微球菌核酸酶的比率，可重复地将染色质消化成合适大小的片段。每个SimpleChIP^®试剂盒为用细胞或组织消化染色质的最优化提供问题诊断指导。
4．为什么我使用微球菌核酸酶来消化染色质时需要超声?
孵育在A、B缓冲液中不足以完全裂解细胞和甲醛交联细胞的核膜。相反，它只是渗透入细胞，使微球菌核酸酶进入，消化染色质。因此，将染色质释放到溶液中就需要少量的超声。超声不会进一步片段化染色质，只是进一步裂解细胞和核膜。
5．每次免疫沉淀我们需要多少染色质？
我们做目的蛋白的免疫沉淀时，常常从4x10⁶个细胞或25mg组织样品开始。这通常转化为每次免疫沉淀需10–20μg染色质。然而，做组蛋白免疫沉淀的话，样品可以少至1x10⁶个细胞或2.5–5μg染色质。在设置免疫沉淀时，染色质通常稀释到1XChIP缓冲液中，得到500μl的免疫沉淀反应液，与抗体孵育过夜。然而，设置实验时也可以不稀释染色质，可将未稀释的染色质置于任何理想的体积。
6．正确的抗体条件是什么？
如果抗体在CST已经过ChIP验证，请参考抗体产品说明书以得到每次IP所需的正确抗体量。与SimpleChIP®试剂盒配套使用时，所用的稀释度可从“建议抗体稀释度”中获得，而验证实验中使用的抗体的准确体积和染色质的量会在抗体产品说明书的“染色质免疫沉淀”附图说明中提供。在CST验证抗体时，我们经常以4x10⁶细胞(10–20μg染色质)来确定最优的稀释度。
如果抗体在CST未经过验证，我们不能保证ChIP分析中抗体的表现。如果有人想尝试将抗体用于ChIP分析，我们推荐使用已在normalIP中验证过的抗体，且每次ChIP实验用2–5μg抗体。如果客户使用我们没有验证过的抗体获得了好的实验结果，希望能够给我们反馈。
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