In-Cell Western™介绍及操作方法
In-Cell Western™是一个简单而又经济的定量整个细胞内信号的方法！
可精确测量信号诱导或抑制后每孔的数据，通过LI-COR® Odyssey®红外成像系统获得，具有在每个培养皿上进行多重处理、终点和复制的潜力。
一 . In-Cell Western™ 操作方法
A.所需溶液和试剂
所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。
1. 10 X磷酸盐缓冲液（PBS）：在800 ml水中加入80 g 氯化钠（NaCl），2 g 氯化钾（KCl）14.4 g磷酸氢二钠（Na2HPO4）and 2.4 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）。调节pH到7.4，定容至1 L。
2. 甲醛溶液，16%，无甲醇的类型，Polysciences, Inc. (cat# 18814)，现配现用。开封以后放在4°C避光保存。使用时用PBS稀释。
3. 封闭缓冲液：配制25 ml时，2.5 ml 10 X PBS和1.25 ml正常血清（来源与二抗相同，例如正常山羊血清，正常驴血清）加入到21.25 ml的蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入75 µL Triton X-100 (100%)。
4. 抗体稀释缓冲液：配制40 ml时，取4 ml 10 X PBS加入36 ml蒸馏水，混匀。加入0.4 g BSA，混匀溶解。边搅拌边加入120 µL Triton X-100 (100%)。
5. 荧光素标记的二抗。
不论是一抗还是荧光素标记的二抗，第一次使用时都需要做滴定分析，以判断何种稀释比例可以在目的样品上得到最强的特异信号，同时背景最低。
B.固定和免疫标记
我们建议实验前尝试不同的固定方法以找到适合所用抗体和细胞的最佳固定方法。
注意事项：
细胞应当直接在多孔板中培养，处理，固定和染色。
为避免细胞在细胞培养孔中的不均匀分布，将培养板先在室温下静置1小时，然后再放到37°C培养箱中。
二．测量与分析
PhosphoPlus® In-Cell Duet Kits 可独立测量和标准化磷酸化蛋白的水平。
MDA-MB-468 细胞用不同浓度的LY294002 (PI3 Kinase Inhibitor) #9901处理2小时，接着用hEGF #8916刺激20分钟后的结果分析。用PhosphoPlus® Akt (Ser473) In-Cell Duet (ICW Compatible) #7255同时检测Akt的磷酸化状态和总蛋白表达水平。随着LY294002浓度的升高，Akt的磷酸化信号相比hEGF刺激的对照急剧下降（约3倍），而Akt总蛋白水平保持不变并用来统一校正数据。当用Akt的磷酸化作为检测指标，这个化合物的IC50为2.7μM。数据和图像都可以从LI-COR® Biosciences Odyssey®红外成像系统中得到。
三．ICW 相关试剂
DyLight®偶联二抗
我们推荐使用secondary antibodies conjugated to DyLight® 680 or 800近红外荧光染料。因为DyLight®染料具有低背景荧光，高灵敏度，耐光性，容易定量。
DRAQ5
这种染料可用于根据细胞数调整抗体信号，消除潜在的结合干扰，这种干扰可能发生在未广泛检测活化状态和总蛋白抗体的兼容性时。
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No. |
Name |
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4084 |
PhosphoSitePlus ® |
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