第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的主流技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长(read)能达到400bp;Solexa测序性价相比较高，运行成本低，本文侧重讲解一下454FLX测序。
操作流程：
原理：人们将单链DNA文库固定于专门设计的DNA捕获磁珠上，不同的磁珠上固定有不同的单链DNA片段，随后经过乳液PCR扩增，形成单分子多拷贝的分子簇。将磁珠从乳液体系里面释放出来以后放入PTP板上只能容纳单个磁珠的小孔中进行后续的测序反应。利用焦磷酸测序基本原理，对每个小孔中的DNA片段分子进行准确快速的碱基序列的测定。该技术平台最主要的优点就测序读长较长，目前可以准确进行400个以上的碱基序列分析。
其中文库的制备是二代测序的关键一步NEB公司生产的NEBNext DNA 文库制备试剂盒能够制出更高的文库产量，满足更多实验所需。您制备文库的最佳选择。NEB文库制备提供两种方法。见下图：
二代测序可应用的范围：
1.从头测序(de-novo sequencing)和重测序
如果对照一个参考基因组，新一代测序技术可以短时间内非常轻松的完成一个基因组的重测序。
2.应用于小分子RNA (microRNA,miRNA)或非编码RNA(ncRNA)表达研究
非编码的小分子RNA参与了许多重要的生物发育过程。它们的序列长度很短，只有18-40个核苷酸，正好在新一代高通量测序技术的读长范围内。第二代测序方法还能发现新的小分子RNA。如利用Illumina的新一代测序技术对人胚胎干细胞发育前后的分析，获得了334个已知的和104个新发现的小RNA的表达谱。
3.转录调控研究(ChIP-seq)
染色体免疫共沉淀( chromatin immune precipitation, ChIP)技术是研究蛋白2DNA相互作用的重要方法，把免疫共沉淀技术和第二代测序技术结合，ChIPsequencing(ChIP-seq)，可以在基因组水平上很方便的检测某种蛋白所结合的DNA序列，全面了解蛋白与DNA的相互作用。
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