RNAi（RNA干扰）是由Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello在线虫实验中发现的，他们也因此获得了诺贝尔生理学/医学奖。
RNAi技术是一种基因被“knockdown”的方法，验证目标蛋白表达量降低时，抗体与抗原发生的结合产生的目的条带是否会降低或消除。慢病毒转染的RNAi技术共包括引物设计、克隆构建、慢病毒包装、慢病毒感染靶细胞、Western blot 检测这五个模块。
1、引物设计
优先在文献中查找，然后再利用网站进行设计。
其中最重要的一步是把RNAi干扰序列进行NCBI→Blast，确保干扰序列只跟目的基因的mRNA相结合，保证特异性。在找好序列之后，根据所选用siRNA表达载体，插入到引物框架中，比如:
2、克隆构建
siRNA引物合成好了之后就可以进行克隆构建了。正反向引物缓慢退火，露出BamH1和 EcoR1 的粘性末端，然后与酶切后的PLVX载体进行连接，筛选阳性克隆送测序。
3、慢病毒包装
慢病毒包装就是将PLVX-shRNA、PSPAX2和PMD2.G按质量比3:2:1 的比例混合转染进入293T细胞（细胞密度90%-100%）。
4、慢病毒感染靶细胞
感染用的靶细胞通常选择靶标蛋白表达丰度高的细胞。通常情况下，在感染48小时之后可以直接收集细胞做RT-PCR或者western blot 检测。如果感染效率不高或者有其他要求，可以根据慢病毒载体带有的抗性（G418 或者 puromycin ）对细胞进行筛选。药物的筛选要先做浓度梯度实验，找出最佳筛选浓度，不同的细胞对药物的耐受性不尽相同。
5、Western blot检测
收集细胞后进行siRNA干扰效果的western blot 检测。Western blot 检测有两个需要注意的地方，一个是要设置对照组，另一个是实验组和对照组的内参要一致。
以Proteintech检测的CPT1A 为例，western blot 检测结果如下图：
该次检测显示在内参条带一致时，目的基因CPT1A的表达量被成功的敲低。
最后带大家一起欣赏Proteintech的几个RNA干扰图片。
RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速，相信在不久的将来，RNAi技术能够进入临床，解决人类各种不适困扰。
