固定样本的目的是为了长久保持细胞的状态。通过化学试剂处理样本，从而固定细胞结构和蛋白分布。固定剂大体可分为两大类：交联剂和有机溶剂。交联剂大多采用的是甲醛、多聚甲醛等醛类物质，这一类固定剂通过醛基与蛋白质发生交联反应，形成网络，保持蛋白质的位置和结构，是最常用的固定剂。在少数情况下，可能会用到有机溶剂类固定剂，如甲醇、丙酮等。它们是通过变性蛋白质的方式对组织进行固定。

为了在固定过程中最大限度地减少固定剂对抗原和细胞结构的破坏，针对不同的细胞器建议采用不同的固定剂。细胞核膜、细胞核仁、中心体、溶酶体、核糖体、自噬体等建议首选有机溶剂来固定。细胞核、高尔基体、内质网、纤毛、纺锤体、线粒体等建议首选交联剂固定。然而固定剂的选择没有通用规则，倘若没有达到预期效果，可以更换另一种固定剂。
2.通透细胞膜
通透，就是在细胞膜上打孔，使封闭液和抗体能够进入细胞。一般情况下，采用醛类固定剂固定的样本需通透细胞膜，而有机溶剂类固定剂本身就可以通透细胞膜，固定后的细胞不需要再增加通透步骤。通透一般采用表面活性剂Triton-X^TM 100。
3.封闭抗体非特异性结合位点
免疫荧光里，需要封闭掉抗体非特异性结合位点，封闭液一般采用与二抗同来源的血清。
4.孵育一抗/二抗
用于免疫荧光的一抗，有些偶联了荧光基团，可直接检测荧光信号，更多的一抗没有偶联荧光基团，需要偶联荧光基团的二抗与一抗结合。一抗的特异性和灵敏度是免疫荧光成功与否的关键。
5.细胞核复染
复染的染料有多种，复染可以在二抗孵育后单独进行，也可以采用含有DAPI的封片剂直接封片。后面的表格中小编给大家总结了CST可用于细胞核复染的染料。
6.封片
为了防止荧光淬灭，还需要使用封片剂，CST的ProLong® Gold Antifade Reagent。对荧光淬灭具有很好的抑制效果。使用这种封片液时，盖好盖玻片后记得将载玻片放在黑暗处固化24hr，达到最佳的防淬灭效果。
为了让大家省心，CST为大家准备了免疫荧光应用试剂盒（含洗液、固定剂、封闭剂、抗体稀释液），让您的实验省心省时又省力。

为了使您的免疫荧光效果更好，CST还为大家准备了信号增强剂和背景抑制剂。Image-iT® FX Signal Enhancer通过有效抑制阴离子荧光染料和阳离子细胞和组织组分的非特异性静电相互作用， 能显著提高免疫标记细胞和组织的信噪比。BackDrop® Green Background Suppressor 是一种新试剂，能有效抑制绿色背景荧光，提高活细胞图像质量并避免培养基去除和潜在的细胞丢失。BackDrop® Green 在方便的滴瓶中提供现成液体，可直接用于活细胞成像样品。

此外，想要获得高质量的免疫荧光图，还有以下几个方面需要您考虑。

首先是细胞健康状态，细胞的状态会直接影响你的实验结果。如果细胞状态不好，极可能会突变成多核细胞、形成应激颗粒、遭到支原体污染或出现死亡细胞碎片。

其次是细胞融合度，有时候我们需要观察高密度培养的细胞信号，然而，如果细胞密度过高，视野中无可界定的边缘，所拍摄的图片将不具说明意义。另一方面，如果细胞密度过低，你能选择拍摄的视野就会非常有限。对于视野和放大倍数的选择，尽量选择细胞数量合适的视野（我们一般选择细胞数量大于3的区域）来显示抗体的着色，如果染色的异质性较强，则要确保所选取区域能够展示这一点。如果为了扩大范围而过于缩小放大倍率，就会看不清亚细胞定位（如有丝分裂和黏着斑）。

最后，也是最重要的，就是要选择质量过硬的抗体，友谊中联向您推荐CST抗体，质量稳定，灵敏度高、特异性强，是免疫荧光成功的不二法门。这里小编给大家总结了CST 用于免疫荧光的封片剂、二抗、用于细胞染色的染料、以及小包装细胞标记物抗体套装。贴心总结，助力您的科研。

封片剂

荧光二抗

细胞染料

小包装细胞标记物抗体套装

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