Western blot是蛋白表达验证中最常用的实验检测手段之一，在实验中很多小伙伴经常会遇到杂不出目的条带，观察条带大小与预估大小不相同，或是杂带等情况。关于wb条带位置与预期不相符的情况，在之前的推文中，小编已经给大家做过一些介绍。今天，关于这个经典的问题，我们再来细细聊一聊。

Western blot主要实验流程有样品制备、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、抗体孵育、蛋白检测等。

很多时候，Western blot结果不理想，与样品制备有很大关系。关于样品制备，小编给大家总结了几点注意事项。

之前，小编收到客户投诉，购买的磷酸化抗体杂不出目的条带。经厂家技术专家分析，客户检测的磷酸化靶标，样本需要有合适的刺激才会表达。而客户的刺激条件不合适，样本不表达目的靶标，因此抗体检测不到目的条带。客户采纳厂家技术专家的建议，成功地杂出了目的条带。

也有客户购买抗体后，一直杂不出条带，做了很多次，结果总是“白板”。客户怀疑是抗体的问题，找到小编投诉。经过厂家技术专家的分析，客户用的细胞系本身不表达此蛋白，换了细胞系后，杂出了目的条带，并且抗体的特异性非常好。

另外还有客户购买抗体后，杂不出目的条带，怀疑抗体质量有问题，经过厂家复检，客户用的细胞系表达丰度很低，建议客户超声处理样品，并增大上样量。最终客户做出了满意的结果。

关于“杂带”的问题，也许您所看到的“杂带”并不杂，很可能是您忽略了以下问题。

蛋白的翻译后修饰经常会引起蛋白在SDS-PAGE 凝胶中的表观分子量不同于根据氨基酸序列换算出的预测分子量。这些修饰包括磷酸化，甲基化，乙酰化，泛素化以及SUMO化等等。样品中某一蛋白同时存在不同的修饰时，经常会造成膜上检测出多个条带。

翻译后剪切也是一方面的原因。各种mRNA剪切体的不同表达模式也可以改变分子量，不同的样本模型也可能是一方面的原因。对于部分蛋白存在的特殊结构，如：p53蛋白表观分子量是53kDa（这也是该蛋白名字的由来），但是根据氨基酸序列计算得到的分子量却是43kDa。

   除了以上各种情况，SDS-PAGE 凝胶的成分和跑胶的条件以及预染marker自身所带电荷也都是一些重要的影响因子。

关于SDS-PAGE电泳，小编总结了几点注意事项，供大家参考。

电泳时，PH 值和浓度准确性很重要，避免跑的过程中胶发热，发烫。

关于转膜，Western blot 常用的膜有2 种，PVDF 和NC 膜，通常我们更推荐0.2um 的NC 膜，背景更干净，适合常见的所有大小的靶蛋白。转膜方法有湿转、半干转、干转。湿转更完全，应用更广，是我们更推荐的方法。转膜效率可以用丽春红染料染下膜来判断。

蛋白转移到膜上之后，膜上还有许多地方是没有蛋白的，需要将膜进行封闭，以减少抗体与空白膜的非特异性结合。封闭推荐用5% 脱脂奶粉配置在1*TBST 里，若是荧光WB，封闭液里不加Tween20。

抗体孵育和检测，是做Western blot的关键步骤。好的抗体需要具备高特异性、高灵敏度、可重复性等特点。友谊中联代理金普来，为您提供蛋白电泳所需的各种耗材。

友谊中联致力成为中国生物科学和生物产业的引导者，代理品牌抗体均经过厂家严格验证，特异性强，灵敏度高，批次间稳定，为您的实验保驾护航！