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技术资料
IHC常见问题疑难解答
发布时间:2019-06-03 13:59 来源:网络
一、无染色或染色弱 

样本存放
切片存放时间过长会导致没有信号,具体取决于靶标,不同的蛋白会存在各异的情况。由于无法对每一种蛋白验证、评估存放时间对于染色的影响,因此建议最好是使用新鲜制备的切片。如果确实需要储存切片,请将其置于4°C,储存时间取决于靶标,但也要尽快使用。此外,储存前请勿烘烤切片。

组织切片干片
在实验过程中除了特定的步骤,切忌干片,需要保持有液体覆盖其上。

切片制备
脱蜡不彻底会导致斑点出现以及不均匀的背景染色。使用新的二甲苯重新制备切片。

抗原修复
固定过的组织中的蛋白间会存在化学交联。取决于组织及蛋白,这会阻碍抗体和抗原的结合以及抗原表位的遮蔽。抗原修复这一步会用到热水浴、微波炉或压力锅。但是我们不推荐使用热水浴来修复。更倾向于使用微波炉来进行修复。此外,一些特定的组织或靶标抗原会需要用到压力锅来进行修复。

抗原修复所用的缓冲液
对特定组织或靶标抗原,其染色需使用经实验优化验证过的缓冲液。具体请参见每个产品说明书上注明的抗原修复缓冲液类型。另外,每次使用新鲜配置的1X修复液。

抗体稀释比例及稀释液
具体请参见每个产品说明书上注明的稀释比例和稀释液类型。抗体的稀释比例需要自己摸索以找到最合适的使用量。

孵育时间
按照严格验证过的实验步骤进行抗体孵育会得到稳定、可重复的结果。

检测系统
验证结果发现,聚合物二抗检测系统如SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (#8114) 和 (#8125), 与SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)搭配使用会得到比传统的ABC法灵敏得多的信号。此外,常见的偶联了HRP的普通二抗也不足以产生足够放大的信号。使用前还要查看产品是否过期。

阴性结果
若一点信号也没有,提示原因可能来自于抗体或实验过程。使用表达靶标的阳性参照样本如细胞团块石蜡包埋切片来进行实验,以找出原因所在。 
需要注意的是,磷酸化靶标或是表达量很低的靶标有时确实很难得到较好的染色,很有可能所用的样本中没有上述蛋白的表达。

二、高背景

切片制备
脱蜡不彻底会导致斑点出现以及不均匀的背景染色。使用新的二甲苯重新制备切片。

淬灭过氧化物酶
如果使用HRP类的二抗系统,内源的过氧化物酶会导致额外的背景。在孵育一抗前使用3% H2O2(RODI水配置)淬灭10分钟。

生物素封闭
使用生物素类的二抗系统来检测如肾脏和肝脏等富含生物素的样本时会出现问题。在这些情况下,使用聚合物类检测系统, 如CST的SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (#8114)和 (#8125)。那么,可以在常规的封闭步骤之后加上额外的生物素封闭的步骤。

封闭
使用恰当的封闭液进行封闭。若使用来自于山羊的二抗,那么在一抗孵育前,用含有5% Normal Goat Serum 的1X TBST 封闭30分钟。

抗体稀释比例及稀释液
具体请参见每个产品说明书上注明的稀释比例和稀释液类型。抗体的稀释比例需要自己摸索以找到最合适的使用量。

二抗交叉反应
在检测与二抗来源种属一样的样本时,由于二抗可能会结合内源IgG,因此会产生高背景。使用对照切片进行测试,在不加一抗仅加入二抗的情况下来确定是否高背景的原因是来自于此。

清洗
充分的清洗对于衬托强信号与低背景十分重要。在孵育一、二抗后分别清洗切片3次(每次5分钟)。