Western blot 酶事儿

回顾我们往期推文，凡是讲到Western blot的地方，我们经常会见到“酶”的影子。例如在讲Cadherin（钙粘蛋白）的时候，胰酶消化掉了Cadherin导致Western blot结果检测不到目的条带；在讲beta-actin的时候，actin被蛋白酶剪切出现两条带……似乎在WB过程中，“酶”成了“霉”的代名词，结果总是不如人意。然而，事实上，有两类工具酶会在WB中带来十分重要的帮助——磷酸酶和糖苷酶。

先来说说磷酸酶。相信研究信号通路的童鞋应该十分熟悉，蛋白质的磷酸化和去磷酸化是信号转导过程中十分常见也是十分重要的过程，蛋白质的磷酸化是由蛋白激酶催化的，而去磷酸化则是由磷酸酶催化的。
在WB实验中，实验结果经常会在预测大小附近出现两条相隔很近的条带，很有可能其中一条就是磷酸化的条带，这个时候磷酸酶就是验证该条带最便捷的方法了；通过磷酸酶处理去除磷酸化，再检测条带变化，分子量较大条带消失或减弱则表明该条带为磷酸化条带。
并且作为抗体生产商，我们也会借助磷酸酶验证磷酸化修饰靶抗体的特异性，例如我们的RIPK1 Phospho S161单抗的验证，我们可以看到将膜经过λ-PPase处理切掉磷酸基团后可以看到目的条带消失：


值得注意的是：商品化的磷酸酶，尤其是使用最广泛的λ-PPase，在蛋白裂解液中可能会失活，使用时需要参考厂家的说明书确认反应buffer是否兼容。条件允许的情况下，可以在转膜后在膜上酶切。
 
再来看看糖苷酶。我们经常会遇到很多蛋白（尤其是膜蛋白）在WB检测时发现分子量比计算值要大出一截，往往可以通过软件分析或数据库查询到它糖基化修饰，如果想要确认这一修饰就可以使用糖苷酶来验证了。
 
举例说明：CD2分子，它全长351aa， 计算大小39kDa，但是由于有糖基化修饰，所以WB中检测到的通常是其糖基化修饰形式50kDa左右的条带，如果想确认这10kDa左右的偏差是否是由糖基化造成，这时候就可以借助糖苷酶来辅助判断了，用糖苷酶PNGase F切去糖基后，可以看到WB条带跑到计算值附近：
 

常用的糖苷酶有三种:
1. PNGase F, 可以切去几乎所有类型的N-糖链（与Asn连接的）。
2. Endo H，只能切高甘露糖型和少数杂合型N-糖，主要用来判断修饰的糖是何种糖型。
3. O-Glycosidase，故名思义就是切去O-糖了，主要切Ser或Thr残基上的Core 1和Core 3型O-糖。
相对磷酸酶而言，糖苷酶切的结果可能比预期的复杂，如有需要可参阅我们预备的FAQ:

其实不论是磷酸酶，糖苷酶还是蛋白酶，每一个酶的存在都有着其使命和功能，只要合理设计实验，辅以严谨细致操作，所有的酶都能成为我们手中有用的工具！正在做WB的你，学会了吗？
最后，show 一波Proteintech 抗体酶切验证数据，切走“霉”运，切出数据！